北京金百特生物技术有限公司

货号	产品名称	规格	价格	优惠价
V112-10	V112 One Step Gibson Cloning Kit (可连接1-5个片段) ★★★	10次	320元	256元
V112-50	V112 One Step Gibson Cloning Kit (可连接1-5个片段) ★★★	50次	1100元	880元
V112-100	V112 One Step Gibson Cloning Kit (可连接1-5个片段) ★★★	100次	1890元	1512元

One Step Gibson Cloning Kit是根据Gibson原理的无缝克隆技术研制而成，可简单、快速、高效地将目的片段定向克隆至载体的特定位点。

仅需设计15-25bp同源臂，一次实现1-5个片段重组，形成长度达48kb的重组质粒。一管式mix，兼容高低片段投入量(0.003-0.25pmol)、高低GC同源臂、纯度差/未纯化样本等。

金百特 Gibson无缝克隆

每一次试验均能为你节省80分钟！    随便挑一个都是阳性!      让你从此爱上无缝克隆！成就感爆棚！

配制连接体系（酶切原液、PCR原液）---50℃连接30min---加入感受态---冰浴5min---42℃热激1min---冰浴2min---复苏15min---涂板

举例（直接用 酶切原液、PCR原液 配制连接体系）

① 8k载体8ug，用50ul体系酶切，酶切后160 ng/ul，无缝克隆加3 ul载体酶切原液（不做胶回收）；

② PCR扩增35个循环，此时默认PCR原液的浓度是300 ng/ul，目的条带单一的话，不用切胶纯化，无缝克隆加2 ul PCR原液；

③ 加入5 ul 2x无缝克隆mix，50度抚育30 min。

配制连接体系（纯化后的载体、DNA片段）---50℃连接15min---加入感受态---冰浴5min---42℃热激1min---冰浴2min---复苏15min---涂板

独特优势：

1、Gibson优秀的设计原理，杜绝外源基因（细菌DNA片段）片段插入，为你从源头消除隐患！

2、无需PCR纯化，支持直接用酶切原液、PCR原液（目的条带单一）直接配制无缝克隆反应体系！

3、体外即可达到闭合环状质粒，减少转化时与感受态的摩擦力，转化率高，长斑多，阳性率高！

Gibson原理：

Gibson Assembly原理的cloning mix包含3种酶，分别是T5 exonuclease、Phusion DNA polymerase和Taq DNA Ligase，它们协同作用：首先利用T5 exonuclease的5’→ 3’外切酶活性，产生3’黏性末端，之后同源臂进行互补配对，再利用Phusion DNA polymerase延伸补齐片段上的缺口部分，最后通过Taq DNA Ligase连接DNA片段中的缺刻，完成克隆组装得到一个闭合环状的质粒。（与单一重组酶的mix相比，Gibson采用3种酶协同作用，效率更高，而且避免了在缺刻处插入外源基因的风险。）

紫红色和绿色2个片段为需要连接的双链DNA片段，它们末端有相同的15-25个重叠序列（黑色）

同源臂设计示例：

(1). 单个插入片段克隆引物设计：克隆引物包括插入片段特异性引物序列和重叠序列。

克隆正向引物(5’-3’)：线性载体正向16-25 nt重叠区序列(3’末端算起)+插入片段正向特异引物序列（18-25 nt）

克隆反向引物(5’-3’)：线性载体反向16-25 nt重叠区序列(3’末端算起)+插入片段反向特异引物序列（18-25 nt）

注意：重叠区的碱基数至少15 bp，并且多段重叠区域之间的Tm值需保持一致且﹥60°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C)，否则可延长碱基数目直到符合要求。计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算。

按照线性载体末端的结构（5’突出，3’突出，平末端），引物设计也分3种情况，示意如下：

线性化载体的两端因线性方式（如单酶切、双酶切、反向PCR）不同，可以是以上三种末端结构的两两任意组合，插入片段特异性引物设计的原则遵循一般引物设计的原则即可。

正向引物设计举例说明（EcoR I 酶切开）：

 

如上图，载体由Ecor I 酶切开，形成5’突出末端：

根据上述设计原则，从3’端开始计算，往回算15bp-25bp（本举例采用了20 bp末端重叠相同序列），加到目的片段特异引物序列前面即可。确保重叠区域的Tm值保持一致且﹥60°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C)。

正向引物具体如下：5' — GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

注意：以上引物设计完成克隆连接后，EcoR I 酶切位点将会消失（不保留酶切位点）。

如果需要保留 EcoR I 酶切位点，需要在载体末端20 bp重叠序列和目的片段特异引物序列之间补齐缺失的EcoR I 识别位点序列aattc，完成克隆连接后，EcoR I 酶切位点依然存在（保留酶切位点）。

具体如下：5' — GAGCCTAGGTGAGTTGGCCG aattc NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

反向引物设计举例说明（Hind III 酶切开）：

如上图，载体由Hind III 酶切开，形成5’突出末端：

根据上述设计原则，从3’端开始计算，往回算16bp-25bp（本举例采用了20 bp末端重叠相同序列），加到目的片段特异引物序列前面即可。确保重叠区域的Tm值保持一致且﹥60°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C)。

反向引物具体如下：5' — CTGCCATCGGATCGTTCGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

注意：以上引物设计完成克隆连接后，Hind III 切位点将会消失（不保留酶切位点）。

如果需要保留 Hind III 酶切位点，需要在载体末端20 bp重叠序列和目的片段特异引物序列之间补齐缺失的Hind III 识别位点序列agctt ，Hind III 酶切位点依然存在（保留酶切位点）。

具体如下：5' — CTGCCATCGGATCGTTCGCA agctt NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

(2). 多个插入片段的克隆引物设计：与载体两端连接的插入片段引物设计方法同单片段设计方法，片段与片段之间连接的插入片段引物设计方法见下图例：

* 多个插入片段之间重叠区设计有上述*标记(蓝色和红色）的两种方式，在多片段引物设计时，选择任意一种方式或者两种方式混用均可，保证片段与片段之间有15-25bp 的重叠区。

载体、片段使用量计算：

单片段同源重组反应：

最适克隆载体使用量 = [0.02 × 克隆载体碱基对数] ng ( 0.03 pmol )

最适插入片段使用量 = [0.04 × 插入片段碱基对数] ng ( 0.06 pmol )

多片段同源重组反应：

最适克隆载体使用量 = [0.02 × 克隆载体碱基对数] ng ( 0.03 pmol )

每个片段的最适使用量 = [0.02 × 每个片段碱基对数] ng ( 0.03 pmol )

1、杂质兼容性强：支持直接用酶切原液、PCR原液（目的条带单一）去配制Gibson连接体系。

2、优秀的Gibson设计理念：5-30分钟，在菌体外，即可完成闭合环状质粒的构建，杜绝外源基因的插入。

3、 15分钟可以将一个或者多个长、短PCR扩增片段（平端、A端均可）插入载体。
4、不受载体和插入片段酶切位点的可用性和平端/粘性末端的限制，可以在任意位点进行克隆。
5、无缝克隆，插入点不会引入不需要的碱基序列。
6、 高效、准确，阳性率＞95% 。