V019 一管式定点突变试剂盒
| 货号 | 产品名称 | 规格 | 价格 | 优惠价 |
|---|---|---|---|---|
| V019-10 | V019 一管式定点突变试剂盒 | 10次 | 700元 | |
| V019-20 | V019 一管式定点突变试剂盒 | 20次 | 1300元 |
本定点突变试剂盒是基于PCR原理向目的DNA片段（一般为质粒）中引入碱基的点突变，多个邻近密码子的突变，单个或多个邻近密码子的缺失(deletion)或插入(insertion)等。
一般宿主菌培养扩增的质粒DNA是甲基化的，PCR扩增新合成的DNA是非甲基化的。首先以待突变的甲基化质粒为模板，利用高保真的SuperPfu聚合酶实现突变质粒的合成（非甲基化，包含突变点，且有两个缺刻点nick点），再利用Dpn I酶选择性降解甲基化的模板质粒 ，剩下的新合成非甲基化的突变质粒转入大肠杆菌后，质粒中有两个nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。一般可以产生大于90%的突变效率。
1、简单，一个PCR管中完成所有操作，速度最快。
2、采用部分重叠引物设计，使PCR呈指数扩增，扩增产物凝胶电泳可见增加成功率。
3、效率高，使用Dpn I去除非突变模板，突变效率高达90%；不需要使用特殊感受态细胞降解非突变质粒。
4、采用分子进化改造的SuperPfu可以提供4倍-6倍于pfu的扩增速率提高和3倍于pfu的超高保真性。
电泳检测：
取5μl PCR产物，1% 琼脂糖凝胶电泳检测。如能看见目的条带(或者见到目的条带外还有其它条带），则可预判基本成功；注意即使未见条带，也可以继续进行后续步骤，但是成功几率大大降低。
PCR产物的消化：
直接加 0.5μl Dpn I酶于PCR产物中（约20μl），充分混匀，继续PCR仪器上37 ℃孵育1小时（不用热盖）。
注意：Dpn I含甘油，易沉底，一定要吹打混匀。如果非突变质粒较多，可以延长消化时间到3-5小时。
转化：
加入5-10μl Dpn I酶消化产物于50μl-100μl感受态细胞中(效率≥10的8次方)，轻弹混匀，冰浴30 分钟。按照标准转化步骤转化，最后将菌液铺板，培养过夜（为得到较多的克隆，4000 rpm 离心1min，弃掉部分上清，保留100-150μl，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜）。
注意：应该选择效率高的感受态细胞，如无克隆生长，或克隆数少，可以将20μl 消化产物全部转入200μl感受态细胞中，或者把Dpn I酶消化后的产物用常规的乙醇沉淀浓缩，这样就可以把所有的产物全部用于转化。
