北京金百特生物技术有限公司

货号	产品名称	规格	价格	优惠价
P505-50	P505 script III miRNA First Stand Synthesis Kit（颈环法，需自己设计颈环引物）	50次	700元
P505-100	P505 script III miRNA First Stand Synthesis Kit（颈环法，需自己设计颈环引物）	100次	1350元

Script III miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stem-loop）采用第三代高效逆转录酶，具有更强的延伸能力和稳定性，并配备了具有DNA分解活性的特殊dsDNase，只需一步操作， 即可同时完成基因组清除与茎环法miRNA逆转录反应，操作方便快捷。逆转录产物可以用于后续的染料法或探针法荧光定量检测。此方法特异性高只对成熟的miRNA进行反转，不受其前体干扰，序列高度同源的miRNA也可精确区分。本试剂盒具有可从20 pg ~ 2 μg的total RNA中高效制备miRNA对应的第一链cDNA。

原理：本试剂盒采用茎环结构的逆转录引物与 miRNA 分子的3’端 结合，并在逆转录酶的作用下进行反应，获得人为加长的 miRNA 第一链 cDNA。

microRNA茎环引物设计方法

1.        stem-loop RT引物设计：

基于通用的茎环结构，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端6个碱基即可。通用茎环结构序列为： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC。

例如设计miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物，只需在通用茎环序列后加上miRNA3’末端的6个碱基的反向互补序列，即

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA CTGGATACGACATACAT。

茎环法qPCR引物设计

1.        Realtime 上游引物设计：

miRNA序列除去3’端6个碱基 的剩余部分作为上游引物，如miR-1的上游引物为(注意 把U改为T)：TGGAATGTAAAGAAGT.检查引物的Tm 值（一般参考DNAMAN），如果Tm值较低，则在5’端加GC使Tm值接近60度。因此miR-1的上游引物可设计 为：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4度。

2、下游引物是通用的，序列为GTGCAGGGTCCGAGGT。

引物设计好后，需要通过预试验检测引物的特异性。一般需要做溶解曲线来检测引物的特异性；同时最好将PCR产物进行电泳检测产物是否单一（产物长度很短，需要3%以上的琼脂糖胶）