Gibson无缝克隆和In-Fusion同源重组，哪个更好用？
发布时间：2022-03-09 浏览次数：次
Gibson 无缝克隆原理
Gibson 无缝克隆非常适合用于拼接多个线性DNA片段，也适合用于将目的DNA插入载体中（构建表达载体）。
Gibson 无缝克隆通过T5 核酸外切酶、Phusion DNA 聚合酶、耐热 DNA 连接酶三种酶的协同作用来实现 DNA 片段的重组连接。
(1) T5核酸外切酶从DNA片段的5'端切割下一条链，产生的单链DNA末端 (overhang同源臂) 两两互补配对，形成一个有间隙 (gap) 的环状DNA；
(2) Phusion DNA聚合酶通过DNA合成填补间隙，产生一个只有缺刻 (nick) 的环状DNA；
(3) Taq DNA连接酶通过形成磷酸二酯键修复缺刻，得到一个完整的双链DNA，也就是质粒。
紫红色和绿色2个片段为需要连接的双链DNA片段，它们末端有相同的15-25个重叠序列（黑色）
这种Gibson Cloning mix含有三种不同类型的酶：
（1）T5 exonuclease：从 5’→3’方向酶切DNA片段，形成较长的单链突出区域，这样便于同源末端进行互补配对。
（2）Phusion DNA polymerase：以单链DNA为模板，延伸补齐片段上的缺口，形成双链 DNA。
（3）Taq DNA Ligase：将DNA片段上的磷酸键连接起来，实现无痕拼接，得到无缝的双链DNA / 质粒。
这个系统最厉害的是，这三种酶都可以在同一个温度下很好的发挥功能，实现了完美协同！
使用不同clonging mix得到的DNA片段：
Gibson无缝克隆：
在体外即可形成闭合环状的质粒。
优势有二：
1、无外源基因插入的风险；
2、无缺口，转化时阻力小，因此转化效率更高！
In-fusion同源重组：
In-Fusion需要先转入细菌体内,再进行缺口的修复，有插入外源基因（细菌DNA）的风险！
Tips1:
In-Fusion原理的Cloning Kit ,它只负责把同源臂接上，质粒上的缺口是需要先转入大肠杆菌后，再利用感 受态的内在体系进行修复，遇到较大缺口时，大概率会插入细菌的基因组片段（特别是在同源臂较长的时候），导致克隆失败！而Gibson原理的Cloning Kit则不会出现这样的问题，在感受态体外已经完成了整个质粒的闭合环状的组装。
Tip2:
由于缺口的原因，质粒转化时，In-Fusion的阻力较大，而Gibson的阻力更小，更容易转进去，得到的转化子就会增多，Gibson无缝克隆效率显著高于重组酶原理的，在一次性插入多个DNA片段的时候，In-Fusion效率较低，甚至经常失败，而Gibson则可以很好的胜任，表出更高的成功率！
NEB公司销售的Gibson组装试剂盒是比较标准的，但价格实在太高，每做一次连接就要花费100RMB，Are you kIdding me？一个大实验室的试剂采购者都知道：what I am talking about！现在市面上有很多生物公司推出了自己的无缝克隆试剂盒，但不管名字怎么变，都是标准Gibson组装的变种，甚至就是相同的产品，呵呵，这些试剂盒价格也低不了多少。若是自己制备Gibson试剂，每个反应的原材料成本只要25RMB。而北京金百特生物的One Step Gibson Cloning Kit （V112-100）仅需1512元/100T！每个反应只要15.12元！
所以，金百特生物采用Gibson 无缝克隆，8年来，不断优化技术指标，性能业界领先，加上销量的逐年上升，生产成本下降，金百特将以更低的价格、更高的品质回馈长期以来支持我们的中国用户。
质控：3000bp的DNA片段插入7000bp的载体
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北京金百特生物技术有限公司
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