北京金百特生物技术有限公司

TOPO系列载体客户效果不好（转化子少）的技术支持疑难解答：

1.首先就是要确认他的PCR扩增片段是好的，用的浓度是对的：
（1）.用什么酶扩增的，扩增出来是否确认是A端，或者是平末端。问这个的目的是防止客户选择了错误的载体，平末端的选择了TA克隆载体，TA克隆选择了平末端载体。 还要注意就是市面上有一些商家用的是混合的酶，是不是带A端有时候就说不清楚了，比如高保真的酶里面掺了TAQ酶，扩出来的可能就不是平末端，是A末端。如果还用平末端的连，效果就不好。
（2）.要跑电泳图看看PCR产物的扩增情况，和marker亮度的对比估计这个PCR产物浓度，电泳的时候是上几微升电泳的？电泳有杂带没有？有引物二聚体没有？来判断是否可以适合直接连接。不适合直接连接的，应该做胶回收，做了胶回收的也同样要跑电泳，上样几微升，和marker做对照估计亮度浓度。然后按照说明书推荐的用量来加。
（3）.按照这样就可以正确的按照说明书推荐的量来做，还可以做个梯度，比如用2ul做一个，4ul做一个，这样总有一个浓度是用对了的。注意：插入片段的量也不是越多越好，加太多了，也会抑制连接反应，造成转化子减少。这种情况下，应该减少量做个梯度试试！
 
2.感受态细胞的效率很重要：
感受态细胞的种类和效率是否合适采用简化过程，这个我们也不知道是否合适，效果不好的情况下，肯定就按照标准的程序来做试试。
 
3.连接的片段的长短也很重要，片段大于2.7K的转化子本来就少，一定要按照标准程序来做：
 
按照一般标准程序做的几个点：
1. 胶回收。
2. 10ul反应体系，5分钟室温连接。
3. 标准感受态冰浴20-30分钟，热休克30-90秒，复苏1小时来做。
4. 10ul体系全部放入100ul感受态细胞，全部用于转化。转化后的菌液瞬间离心十几秒后去上清，剩下150ul上清重悬菌体后全部涂板子。
 
长出很多转化子，但是说菌落PCR是假阳性或者测序说没有信号，都是假阳性的：
这种情况基本可以肯定是连接成功了，因为我们技术含量非常高的零背景载体是不会自连（或者极少自连的）的，如果长出很多转化子，那只有一个可能性，就是连接成功了！如果这种情况下菌落PCR没有，或者测序没有，一般首先考虑是使用错了菌落PCR/测序引物，我们的载体只能用M13正向引物，和反向引物菌P/测序，不能用M13(-47),M13(-48)引物菌P/测序，很多老师以为所有的M13引物都可以用于我们的载体测序，这个是错误的，用了这个不对的M13引物去测序或者做菌落PCR，肯定就做不出来了。可以对比一下自己用的菌落PCR的M13引物或者测序的M13引物是不是和我们说明书上的M13菌落PCR/测序引物序列一致。
 
长出转化子，测序发现都插入了一个很小的片段，仔细比对是引物二聚体：
本载体连接效率超高，如果条带单一，引物二聚体不太明显没有注意到引物二聚体存在，就没有做胶回收直接连接，就容易遭成引物二聚体的短片段插入，因为二聚体占优势而且容易连接，最后就发现全部是二聚体插入，解决方法是做个胶回收就能解决。

TOPO系列载体客户菌落PCR，或者测序鉴定不好的技术支持和疑难解答：
Topo原理载体有时偶然因为插入片段和载体形成复杂二级结构造成菌落PCR失败或者测序失败的可能性。
1. 如果菌落PCR显示阴性的，尤其是长片段的，需要提取质粒跑电泳从质粒大小判断是否有插入，或者再选择载体或插入片段上合适酶切位点酶切鉴定，阳性菌落可以去测序鉴定，测序成功就解决问题，如果测序不成功，可以参考参考invitrogen的TOPO载体的疑难解答。
2. 如果菌落PCR鉴定是阳性的，但是测序不成功，可以参考Invitrogen的TOPO载体的疑难解答。
 What are the possible causes of sequencing problems with the TOPOВ® TA vectors, and are there any suggestions to help solve these issues?
The ends of pCRII and pCR2.1 vectors are palindromic sequences, since both ends must accommodate the TOPOВ® binding sites. Therefore, there is an inherent potential for secondary structure once the vector is ligated. This does not usually affect sequencingВ or PCR results, as cycling conditions are usually sufficient to overcome potential secondary structures that might form. However, certain inserts might enhance the formation of such secondary structures by the regions flanking the cloning site. Strong secondary structures may inhibit the cycleВ sequencingВ reactions commonly used in automatedВ sequencing.
 If you suspect this is a problem for your clone, here are a few things to try:
1.Increase the annealing temperature of the cycling, or even try a two-stage cycling reaction.
2.Add DMSO to the reaction. This may reduce secondary structure formation. However, beware that it may also affect the fluorescence or some other portion of the reaction.
3.Design primers internal to the insert.（使用用插入片段的引物来做菌落PCR或者测序）
4.Last resort: switch to non-cycling conditions, e.g., manual sequencing using sequenase, S-35-labelled dNTPs. This is perhaps the least convenient, but most effective method.
所以注意：如果确实是用TOPO载体不适合失败的情况，例如
（1）、片段太长，连接进去的鉴定后发现大部分是断裂的片段或者缺失了一部分的片段。
（2）、或者连接进去了，跑电泳看大小和酶切鉴定有插入，就是测序没信号无法成功测序的情况下。
可以换用其它原理的载体，
如果是TA克隆，片段在2kb之内的，可以换用V014，如果是平末端克隆，片段在3kb之内的，可以换用V018（不带多克隆酶切位点）或者V113（不带多克隆酶切位点）。
如果长于2kb的TA克隆，和长于3kb的平末端克隆，TOPO原理不适合失败的情况下，建议V112（多片段连接）和V019（单片段连接），无缝克隆。
 
V112 Seamless Assembly and Cloning kit 无缝拼接克隆试剂盒
制品说明：本制品不依赖于T4连接酶，不受载体和目的片段的酶切位点限制，而直接用同源重组的方法，采用特殊的重组酶可以将任意方法线性化后的载体和与其两端具有15-25bp重叠区域的PCR片段定向重组，可以快速实现1-5个片段的高效无缝克隆。
产品特点：
1.30分钟可以将一个或者多个长、短PCR扩增片段（平端、A端均可）插入载体。
2.不受载体和插入片段酶切位点的可用性和平端/粘性末端的限制，可以在任意位点进行克隆。
3.无缝克隆，插入点不会引入不需要的碱基序列。
4.高效、准确，阳性率＞95% 。
V119  One Step Seamless Cloning kit一步法无缝克隆试剂盒
产品储存：-20C保存，避免反复冻融
制品说明：一步法无缝克隆试剂盒不依赖于T4连接酶，不受载体和目的片段的酶切位点限制，而直接用重叠片段重组的方法，采用特殊的酶组合可以将任意方法线性化后的载体和与其两端具有16-25bp重叠区域的PCR片段定向重组连接，可以30分钟内实现A末端或者平末端PCR产物片段高效定向无缝克隆至载体的任意位点。
产品特点：
1.30分钟可以将一个50bp-15kb PCR扩增片段（平末端、A末端均可）克隆插入任意载体的任意位置。
2.不受载体和插入片段酶切位点的可用性和平端/粘性末端的限制，可以在任意位点进行克隆。
3.无缝克隆，插入点不会引入不需要的碱基序列。
4.不依赖于连接酶及磷酸酶，高效，准确，克隆阳性率可达95%以上。
 
最后复杂，难连接的，请使用V119  One Step Seamless Cloning kit或者 V112-Seamless Assembly and Cloning Kit 无缝拼接克隆试剂盒，这两个试剂盒特别适合连接长片段，是基因合成公式经常是用的长片段拼接的方法。阳性率极高。www.gene-better.cn下载说明书。