北京金百特生物技术有限公司

声明：不跑胶图就谈RNA好坏的，都是耍流氓！
因为仪器NarnoDorp2000不能区分DNA和RNA，降解的RNA也能读出高纯的OD比值，所以仪器读数在RNA电泳图合格的前提下才有参考意义！

前言：我们提取总RNA的目的是为了测定成熟的mRNA的表达量，这才是和下游蛋白翻译直接相关的变量。
那么 mRNA在哪里？能看到吗？
答案：真正成熟的mRNA，主要集中在28s与18s之间，以及其上下的涂抹带。
啊？啊？......
原因：一般每条基因mRNA量很少，所以，整体一般看不到明显条带，只表现为28s与18s中间和其上下的的连续的涂抹带smear，就是一些模糊的荧光背景。因此能看到涂抹带更好，看不到呢，就看28s和18s的比例是否是2：1，比例正常我们就认为提出的RNA没有降解，是完好的，进而推理出mRNA也是完好的。

目前总RNA的提取方法主要分两种：离心柱型（RNA吸附柱）和Trizol法。由于人们对健康(是否免氯仿、是否免β-巯基乙醇)和高效（20分钟是否可以获得高质量的总RNA）的关注度的不断提升，离心柱型的总RNA提取试剂盒越来越受欢迎！

一、所以我们先来说说，离心柱型的判断标准
从总RNA电泳图看，判断RNA是否降解的标准有两个：
第一个标准： 28s:18s=2:1
这个标准的意思是28s、18s是否清晰，条带宽度28s是18s的2倍，尤其是亮度，28S比18s越亮越好。如果28s只是比18s稍高，或者亮度差不多，即使条带清晰，也已经提示部分降解了，因为降解，总是从大片段开始降解，从28s降解到18s，最后降解到5s。这样降解过程中，28s减少，18s增多，28s：18s比例就会下降。如果最容易降解的28s都没有降解，（从比例推断），那么，就推理出：更难降解的mRNA肯定是完好的了。当然即使有部分降解的mRNA，甚至降解一大半，也是可以做PCR扩增的，虽然也不会影响PCR扩增，但是这样做荧光定量就很不靠谱了，比如一个降解50%，一个降解了20%，都能扩出来，但是这样这样实际上就无法对比，精确定量了。
第二个标准：5s带不出现
离心柱型的硅胶模，一般不吸附小片段的5s片段，这样，提取出来的5s应该非常淡，或者看不清楚，如果有部分降解，降解后的片段一般会正好位于5s这个位置，这样，如果离心柱型的试剂盒，要是看到明显的5s片段，而28s：18s的比例又不是很大，就高度提示有部分降解。 5s哪里来的？本来离心柱子不吸附小片段的，就是降解的28s，18s变小，形成了5s大小的降解片段。 请参看正常的电泳图。离心柱型的，都不应该见到明显很亮的5s，见到了就是28s，18s降解来的小片段。

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RNA降解图例
下面这张图片就是一个离心柱型试剂盒提取总RNA的不同降解情况的典型例子。
泳道：
          1       2       3      4       5       6       7        8        9


泳道2是完全正常的RNA——大家可以看到28s:18s比例大约是2:1，5s位置也基本见不到带。这就说明完全正常，无降解。
泳道3,4是完全降解了——28s，18s已经基本降解光了。两条带都看不见了。最后降解成的小片段正好和5s大小一致，所以在5s位置看到了大量的一条浓浓的降解小片段。
泳道1,5,6,7,8,9 部分降解了——28s是RNA大片段，更容易降解，所以28s首先降解，表现为28s条带变淡，18s条带明显变粗，造成28s：18s的比例竟然小于1了。然后在不该看到条带或者应该是很弱的5s位置，出现了较明显的5s大小的降解带。

二、trizol法的判断标准：28:18s比例至少要大约1.5:1
如果不是离心柱型的吸附方法提取，而是用异丙醇沉淀，或者乙醇沉淀方法提取的RNA，因为5s小片段也可以一起沉淀，所以，一般会见到明显的5s带，用这种方法提取见到5s带，是正常的，不提示降解。下面就是trizol提取，可以见到明显5s带，这个不代表降解。这个时候判断唯一标准，就是28:18s比例至少要大约1.5:1才提示不降解。这成了唯一标准。如果28s和18s差不多亮，甚至18s比28s还亮就提示降解了。当然，如果5s出奇的亮，那也提示部分降解了，就是部分降解成5s大小的降解带和5s重叠，造成它超出正常范围的亮。

         TRIzol法

知识延伸
曾经很多人问：我提的RNA出现了好几条带，正常吗？
下面是答案，请看下图
               泳道   1   2  3  4   5  6   7   8

     泳道1,2,3,4为microRNA      泳道5,6,7,8为总RNA
28s上面的条带看得见的，主要是剪切前的前体RNA，就是成熟前的前体RNA，主要包括不均一核RNA（未剪切成熟的mRNA前体）和主要是28s，18s,5s的前体转录子。前体存在于细胞核，然后加工剪切成28s，18s，5s和成熟的小片段的mRNA。这些成熟的RNA进入到胞浆。所以，真正我们要用的，有功能的mRNA，是存在于胞浆中的成熟的mRNA，而不是存在于细胞核中的剪切前的前体mRNA，前体mRNA是没有翻译功能的（蛋白质翻译机器，核单倍体是位于胞浆中的）所以，我们真正要测表达水平是胞浆中的成熟的mRNA。
结论：在现今技术水平条件下，RNA电泳图出现好几条带是正常现象。

所以，很多公司，包括核酸纯化领域世界第一品牌Q，还特意研发产品，设计裂解液用来选择性的仅仅裂解细胞膜，而不裂解细胞核膜，这样没有用的细胞核里面的DNA释放就少，DNA污染就少。而且，没有用处的剪切前的前体RNA（不成熟的RNA）就可以尽量少提取出来。所以，是否看到28s上面的带，完全不是判断RNA质量好坏的标准。在此打个广告:北京金百特生物的RNAzol (改进版的trizol) 已经可以做到有效减少DNA和前体RNA的污染，并且允许常温下进行RNA提取的操作。

让天下没有难提的RNA!——北京金百特生物技术有限公司

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